2022年，軍事醫學研究院裴雪濤/李艷華團隊聯合天津大學醫學部張健課題組在干細胞領域期刊Cell Stem Cell在線發表了題為：Direct chemical reprogramming of human cord blood erythroblasts to induced megakaryocytes that produce platelets的研究文章。運用化學重編程技術實現了人成紅細胞向巨核細胞及血小板的命運轉換，并利用單細胞轉錄組和染色質開放性測序技術系統追蹤了該過程中的細胞動態變化。安諾優達為本次研究提供了10x單細胞轉錄組測序服務。
研究背景
血小板（blood platelet，PLT）是血液有形成分之一，是成熟巨核細胞裂解脫落下來的具有生物活性的無核細胞。血小板輸注是臨床治療血小板減少癥、防治出血和挽救生命的主要手段之一。臨床上，血小板供應主要靠健康獻血者捐贈。但是，血小板存儲時間短且易被污染。因此，亟需運用新技術解決血小板來源問題。對此，基于干細胞技術、細胞重編程技術獲取巨核細胞及血小板的研究一直是國際競爭的前沿與熱點領域之一。
在細胞重編程的研究中，種子細胞的選擇對于能否成功而有效地啟動細胞命運轉換至關重要。成紅細胞是存在于骨髓、外周血和臍帶血中的一種有核紅細胞，成紅細胞和巨核細胞在發育過程中來自共同的前體，即巨核-紅系共祖細胞，它們之間緊密的譜系聯系使得成紅細胞成為獲得巨核細胞理想的候選種子細胞。
材料選擇
初始成紅細胞（D0）和第3天（D3）、第5天（D5）以及第7天（D7）的重編程細胞
研究思路
研究結果
4M“cocktail”可以激活EBs的MK命運
通過流式細胞術擴增并純化獲得臍帶血（CB）成紅細胞（EB）。作者選擇4個小分子（4M；Bix01294、RG108、VPA和PD0325901）作為篩選cocktail的基線。通過流式細胞術分析兩種巨核細胞（MK）特異性細胞表面標記物CD41a和CD42b的表達，定義了在4M“cocktail”條件下存在持續7天的MK誘導期。通過觀察GFP+細胞感染慢病毒PF4-GFP，作者發現4M“cocktail”在5和7天重編程階段逐漸啟動了由PF4啟動子驅動的GFP表達（圖1G和1H）。
圖1 小分子誘導EB重編程為iMKs
兩相誘導后的EB衍生的iMKs具有MK特性
圖2 iMKs的特性
EB誘導的iMKs可在體外產生前血小板和功能性血小板
為了探究iMKs是否能在體外產生前血小板和PLT，作者將第14天的iMKs轉移到MK成熟培養基中，培養7天后，發現這些分化的促血小板樣細胞表達CD41、CD42b和vWF（圖3B），表明iMKs成熟為促血小板。通過流式細胞儀分析，作者檢測到這些前血小板能夠產生PLT。免疫熒光染色顯示，iMK-PLTs表達高水平的PLT特征蛋白。
圖3 iMK-PLTs的體外表征
iMKs可以在體內產生功能性血小板
為了評估iMKs是否能在體內產生功能性PLTs，作者采用血小板減低癥的免疫缺陷小鼠進行實驗驗證，發現來自EB的iMKs將人PLT釋放到小鼠血液循環中，iMKs可以在體內持續產生人PLT。作者又在細胞輸血后第3天從血小板減低癥的免疫缺陷小鼠中收集了PLT-rich血漿（PRP）。通過自動微流控室系統評估血栓形成，發現在所有PRP樣品中均有血栓生成（圖4D）。
圖4 誘導巨核細胞（iMKs）在體內產生功能性PLT
scRNA-seq分析確定了MK命運獲取的進程，并描述了重編程路徑
為了分析EBs中iMKs的重編程過程，作者使用10x Genomics平臺對EBs第0天（D0）和重編程第3天（D3）、第5天（D5）和第7天（D7）的細胞進行了單細胞基因表達譜分析，共捕獲了24967個細胞，鑒定出6個轉錄不同的聚類。C1期和C2期的大部分細胞處于G2M期或S期，表明這些細胞處于活性增殖狀態。C3是C1、C2、C4和C5之間的中間狀態。C4和C5其關鍵巨核細胞基因RGS18、F2R、PPBP、PF4的表達水平相似，定義為iMK-1和iMK-2（圖5C和5D）。其中iMK-1為血小板生成偏向性強的巨核細胞；iMK-2是免疫偏向性的巨核系細胞，可能在免疫調節、炎癥調節過程中發揮作用。作者選擇CD53來區分這兩個群體，發現重編程系統更有利于iMK-1的生成。
圖5 使用scRNA-seq對從EBs到iMKs的4M重編程進行高分辨率解析
4M“cocktail”通過染色質重塑誘導EB向iMK的重編程
為了了解4M在EBs向iMKs轉化過程中如何重組染色質結構，ATAC-seq分析發現，在4M誘導后，在重編程細胞中，紅系主調控因子具有封閉的染色質狀態，染色質水平的重編程和這些TFs協調EB細胞和MK細胞的命運轉變。重編程過程中關鍵轉錄因子的染色質狀態，紅細胞發育的主TF基因，MYB和KLF1的表達隨著重編程路徑逐漸減少，與scRNA-seq數據結果顯示一致?？傊?，4M的重編程機制可能涉及降低紅細胞必需TF基因的染色質可及性，并開放EB和MK關鍵TF基因的調控區域，從而驅動MK命運的規范。
圖6 ATAC-seq揭示重編程過程中的染色質動力學
結論
本研究獨辟蹊徑，僅運用小分子化合物成功實現成紅細胞向功能性巨核細胞及血小板的命運轉變，為體外大規模人工制備巨核細胞和血小板開辟了新的路徑。
參考文獻
Qin J, Zhang J, Jiang J, Zhang B, Li J, Lin X, Wang S, Zhu M, Fan Z, Lv Y, He L, Chen L, Yue W, Li Y, Pei X. Direct chemical reprogramming of human cord blood erythroblasts to induced megakaryocytes that produce platelets[J]. Cell Stem Cell. 2022 Aug 4;29(8):1229-1245.e7. doi: 10.1016/j.stem.2022.07.004.